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          公司消息

          多克隆抗體的制備步調

          時光:2015-09-10 閱讀次數:2058

          試驗試劑


          心理鹽水(或PBS)

          弗氏完整佐劑(Freund’s complete adjuvant,FCA)

          弗氏不完整佐劑(Freund’s incomplete adjuvant, FIA)

          二甲苯,酒精棉,脫脂棉,2% NaN3


          錨點

          試驗設備


          鉸剪(剪兔毛用)一把、彎頭眼科手術鑷子(遊離血管用)一把、直頭眼科手術剪(剪血管用)一把,手術刀架,手術刀片,打針器(1ml、10ml,25ml)附針頭,兔子固定架,滅菌三角燒瓶(200ml)或平皿(直徑18cm)、彎頭止血鉗四把,直頭止血鉗兩把,手術縫合線,塑料放血管,紗布等。


          錨點

          試驗資料


          1. 免疫原:卵白或KLH偶聯的多肽。每次免疫100-200μg免疫原。

          2. 兔子的選擇,兔子的分量應在四斤以上,兩耳滑膩,顯著可見耳靜、動脈,安康。


          錨點

          試驗步調


          1. 免疫

          用心理鹽水濃縮免疫原,然後與響應的佐劑停止1:1混雜。抗原和佐劑完整混雜構成穩固的乳劑,將該乳劑在兔子雙肩四周的皮膚下停止皮下打針和後大腿停止肌肉打針。每壹個區域大約用1/4的免疫原。如許免疫原可以耐久存在從而進步免疫應對。

          注:

          抗原打針之前須要搜集一些正常血清,已備檢測抗體時作爲陰性對比。待兔子在新情況中穩固,也許須要四天閣下時光,可以停止耳動脈取血。取血量約5ml足矣。

          免疫用的抗原必需純化,不然影響抗體的質量。抗原經FCA或FIA充足乳化後能力打針。將抗原液與佐劑等比例混雜後,置于混雜器上使之激烈振蕩使抗原充足乳化,乳化進程比擬費時、辛苦,但如果乳化不充足,會影響免疫的後果,振蕩後,1000rpm離心一分鍾,如水相和油相不分層便可打針。免疫用FCA,今後都用FIA。

          免疫辦法可采取背部多點打針法。即于家兔脊柱兩旁選4-6點皮下打針,每點注0.1ml,距離2周後再于上述部位選分歧點打針(不要選擇鄰近位點,不然潰瘍愈合欠好)。每次免疫的抗原量約100μg。免疫次數在四五次便可,抗原用量大可以削減次數。

          2. 取血

          免疫一周後,可以耳動脈取血檢測抗體效價。由於起先幾回免疫發生的抗體的效價比擬低,頭兩次取血,夠檢測用便可。在三次免疫後,可以取得較價的抗體,每次取血量可以在40ml,不要取太多,不然會形成兔子貧血。

          前幾回取血用19號針頭對兔子停止耳動脈取血,室溫過析出血清。

          zui後一次取血可以采取頸動脈放血,詳細操作以下:

             1) 家兔仰臥于兔架上固定頭部,用紗布固定四肢。頭部略放低以裸露頸部。剃毛並消毒皮膚。

             2) 沿頸部中線用手術刀切開皮膚約10cm,分別皮下結締組織,直至裸露出氣管兩側的胸鎖乳突肌(當心操作,如碰著小血管出血,可用止血鉗止血)。

             3) 用直頭止血鉗分別胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區松散組織,裸露出頸總動脈後用彎頭眼科鑷使之遊離,剝離神經和結締組織。

             4) 于動脈下套入兩根黑絲線,分離置于遠心及近心端。結紮遠心真個絲線。近心真個動脈用血管夾夾住。

             5) 用小拇指墊在血管下,用尖頭眼科手術剪在兩根絲線間的動脈璧上剪一小口(勿剪斷),拔出塑料放血管。再快要心真個絲線結紮固定于放血管上,以防放血管滑脫。

             6) 松開止血鉗,使血液流入容器中。普通一只家兔可放血100-120ml。

          3. 血清的分別

          假如用三角瓶或平皿盛血,將器皿傾斜放置于37oC烘箱2hr,轉移到4oC沉澱過,第二天早上用吸管汲取血清。假如用離心管搜集,37oC烘箱放置2hr,轉移到4oC沉澱過,第二天早上離心,10000RCF,10分鍾。在血清中參加NaN3至終濃度0.02%,分裝後-20oC保留。

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                  公司近况

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