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          公司消息

          核酸探針標誌

          時光:2015-09-10 閱讀次數:1914

          試驗道理


          份子生物研討中,zui經常使用的探針即爲雙鏈DNA探針,它普遍運用于轉基因植物拷貝數的判定、臨床診斷等方面。雙鏈DNA探針的分解辦法重要有以下兩種:瘦語平移法和隨機引物分解法。
          瘦語平移法(nick translation) 當雙鏈DNA份子的一條鏈上發生瘦語時,E.coli DNA聚合酶Ⅰ便可將核苷酸銜接到瘦語的3'羟基末尾。同時該酶具有從5'→3'的核酸外切酶活性,能從瘦語的5'端除去核苷酸。因為在切去核苷酸的同時又在瘦語的3'端補上核苷酸,從而使瘦語沿著DNA鏈挪動,用放射性核苷酸取代本來無放射性的核苷酸,將放射性同位素摻入到分解新鏈中。zui適合的瘦語平移片斷通常是50-500個核苷酸。瘦語平移反響受幾種身分的影響: (a) 産物的比活性取決于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的水平。(b) DNA酶的用量和E.coli DNA聚合酶Ⅰ的質量會影響産物片斷的巨細。(c) DNA模板中的克制物如瓊脂糖會克制酶的活性, 故應應用細心純化後的DNA。


          錨點

          試驗試劑


          (1) 10×瘦語平移緩沖液:  0.5M/L Tris-Cl (pH7.2);  0.1M/L MgSO4; 10mM/L DTT;  100ug/ml BSA。

          (2) 未標誌的dNTP原液:除同位素標誌的脫氧三磷酸核苷酸外,其他3種分離消融于50mM/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中,濃度爲0.3mM/L。

          (3) [α-32P] dCTP或[α-32P]dATP:400 Ci/mM, 10uCi/ul。

          (4)E.coli DNA聚合酶Ⅰ:(4單元/ul):溶于50ug/ml BSA, 1mM/L DTT, 50%甘油,50mM/L Tris·Cl(pH7.5)中。

          (5) DNA酶:1mg/ml。

          (6) EDTA :200mM/L (pH8.0)。

                 (7) 10M/L NH4Ac。


          錨點

          試驗步調


          (1) 按以下配比混雜:

              未標誌的dNTP 10ul

              10×瘦語平移緩沖液 5ul

              待標誌的DNA 1ug

              [α-32 P]dCTP或dATP(70uCi) 7ul

              E.coli DNA聚合酶 4單元

              DAN酶 I 1ul

              加水至終體積 50ul

           (2) 置于15℃水浴60分鍾。

           (3) 參加5ul EDTA終止反響。

              (4) 反響液中參加醋酸铵,使終濃度爲0.5M/L, 參加兩倍體積預冷無水乙醇沉澱收受接管DNA探針。


          錨點

          留意事項


             1、3H,32P及35S標誌的dNTP都可以使用于探針標誌,但平日應用[α-32 P]-dNTP。

           2、DNA酶Ⅰ的活性分歧,所獲得的探針比活性也分歧,DNA酶Ⅰ活性高,則所得探針比活性高,但長度比擬短。

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                  公司近况

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