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          公司消息

          DNA試驗技術:份子克隆的經常使用載體

          時光:2013-10-12 閱讀次數:2333

          DNA段的克隆須要適合的載體,載體或是質粒,或是噬菌體,或是病毒,平日大多經由人工改革[地的。作爲載體必需具有兩前提:一是該載體在細胞內必需能自立複制,即必需具有複制原點;二是該載體必需具有合適的酶切位點,且這些酶切位點不在複制原點區域內。以上兩條,包管了載體的可滋生性和可應用性。爲了便于取得陽隆克隆,載體上常有挑選標誌,如反抗菌素的抗性,某些基因産物的顯色反響等。
           
          1、質粒
          經常使用的有pBR322,pUC系列質粒等。

          (一)pBR322質粒是4362bp的環狀雙鏈DNA載體,有2個抗藥性基因(四環素和氨苄青黴素),一個複制肇端點和多個用于克隆 的限制酶切點。當缺掉抗藥性基因的大腸杆菌被pBR322勝利地轉化時,它便從該質粒取得了抗生素抗性。兩個抗生素基因中均含供拔出外源DNA用的分歧的單一酶切位點。普通只選一個抗生素基因作爲拔出外源DNA之用。外源DNA拔出後該抗生素抗性掉活。另外壹抗生素抗性基因則作爲轉化細菌後挑選陽性克隆 之用。

          (二)pUC系列質粒是2.7Kb的雙鏈DNA質粒,有一個複制終點,一個氨苄青黴素抗性基因和一個多克隆位點,多克隆位點處于表達LacZ基因産物-β-半乳糖苷酶的氨基端片斷,用pUC質粒轉化LacZ基因有漸變的大腸杆菌株(M15)時,由於由質粒表達的&alpha;-肽彌補了大腸杆菌卻掉的α-肽,所以恢複了分化半乳糖的才能。在參加IPTG和X-gal的造就基上,長出藍色克隆。假如在多克隆位點內拔出外源DNA,因為它損壞了α-肽的表達,因此在參加IPTG和X-gal的造就基,不克不及長出藍色克隆,這就是所謂的藍白挑選。

          2、單鏈絲狀噬菌體和噬粒

          (一)大腸杆菌絲狀噬菌體包含M13噬菌體f噬菌體等,其基因組 均是單鏈閉環DNA份子,個中M13mp系列克隆載體是對野生型M13加以改革,拔出了多克隆位點和LacZ基因後的載體,所以也是可以應用IPTG和X-gal作藍白挑選的,M13沾染大腸杆菌後,即在菌體內酶的感化下,以沾染性單鏈DNA(正鏈)爲模板,改變爲雙鏈DNA,稱作複制型DNA(RF DNA)。普通當每個細胞內有100-200個RF DNA拷貝時,即停滯複制,發生有沾染性的完全的單鏈絲狀噬菌體並排泄分開菌體。沾染M13的大腸杆菌可持續發展,其實不產生裂解,但發展速度則較正常菌慢,取沾染M13的細菌造就液離心,便可從菌體中提取RF DNA,供限制酶切割等份子克隆操作之用;從離心後的上清液中,可用聚乙二醇(PEG)沉出噬菌體顆粒,提取單鏈DNA(ss DNA)供DNA序列剖析,體外定位漸變等應用。

          (二)噬粒(phagemid)在質粒DNA中拔出一段單鏈噬菌體的複制肇端點DNA,即組成了噬粒,如pGEM-3Zf(-)就是一種噬粒。噬粒可像普通質粒一樣操作,但當須要制備單鏈DNA時,就須要在造就時參加幫助噬菌體,經常使用的幫助噬菌體有M13KO7和R408。造就好的菌液在離心除去菌體後,上清中參加PEG便可沉出含有單鏈DNA的顆粒。噬粒也經常使用于DNA序列剖析和體外定位漸變。份子克隆經常使用載體除上述兩類之外,還有 噬菌體和粘粒,具體情形可參閱有關材料。
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