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          技術文章

          單細胞凝膠電泳尺度操作3

          時光:2017-03-02 閱讀次數:942

          試驗道理

           

          在細胞核中,DNA是環狀附著在核基質上,細胞裂解過程當中,核基質被消融、抽提,DNA的構造則未產生變更。假如DNA鏈上存在缺口,則使DNA超螺旋變的松懈,DNA環向外展,同時因為裸露了陰電荷,在電場力的感化下,松動的DNA環朝陽極遷徙,然則因為這類松動的DNA環一端仍附著于核DNA,其遷徙間隔遭到限制,是以尾長其實不老是真實反應鏈缺口的若幹。現實應該依附尾長與尾部的熒光強度同時來停止剖析。

           

          試驗步調

           

          1. 分別制備單細胞懸液:
             1) 體外造就的細胞株:用胰酶消化,奏樂成單細胞懸液;
             2) 體內髒器細胞:處逝世植物,掏出髒器,于Hanks’液中制備成單個細胞懸液。
          2. 膠板制備:
             1) 取20~50μl于56℃水浴中保溫的0.5%通俗熔點瓊脂糖,鋪于磨沙載玻片上,構成底膠。
             2) 取100~150μl 0.5%通俗熔點瓊脂糖加在底膠上,再于其上加蓋玻片,4℃冷凝10分鍾。
             3) 取下蓋片,取50~100μl于37℃水浴中保溫的1.0%的低熔點瓊脂糖與50~100μl細胞懸液(105個細胞/ml)混勻,立刻鋪片,加上蓋玻片,4℃冷凝10分鍾。
             4) 去失落蓋玻片,取70~100μl于37℃水浴中保溫的0.5%的低熔點瓊脂糖鋪片,加蓋玻片,4℃冷凝。
          3. 細胞裂解與電泳:
             1) 將制備好的膠板去失落蓋玻片後,浸于4℃預冷的細胞裂解液中,4℃裂解1小時。
             2) 掏出膠板,放入電泳槽中,浸泡在電泳液中解旋20分鍾。
             3) 4℃電泳20分鍾(25V,300mA)。
          4. 中和與染色:
             1) 電泳停止,將膠板浸泡于中和液中,每次15分鍾,共中和兩次,留意改換中和液。
             2) 掏出膠板,置于染色架上,滴加5μg/ml的PI,暗處染色20分鍾。
             3) 蒸餾水脫色15分鍾。
          5. 鏡檢和剖析:
             1) 在熒鮮明微鏡下視察,綠光激起接收濾片590nm。需要時拍照記載。
             2) 記數視察的細胞,記載彗星細胞湧現的頻率,用目鏡測微尺測頭長與全長,盤算核DNA遷徙間隔。

          應用兩層凝膠法,經裂解、DNA解旋、電泳和中和獲得濕瓊脂糖凝膠片。將濕瓊脂糖凝膠片置于冰涼無水乙醇中脫水10分鍾,後置于空氣中自覺枯燥。全體操作在采血後8小時內完成,操作過程當中留意避光。應用50µl 30µM的溴乙錠溶液染色、拍照。應用單細胞凝膠電泳軟件剖析壹切照片,隨機丈量100個以上細胞的尾長和olive尾矩,以尾長和olive尾矩的算術均數代表個別DNA毀傷情形。

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                  公司近况

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